女人斩首和肢解:正常人血浆中肝素的浓度是多少

血浆肝素水平的监测，现以凝固试验应用较多，如凝血酶时间、部分凝血活酶时间等〔1～3〕，这些方法均是以一段时间范围衡量肝素的抗凝活性，无法精确定量测定。最近有高效液相色谱法分离测定血中游离肝素含量的报道〔4〕。本文介绍用高效毛细管电泳法(HPCE)测定血浆中肝素含量，能直接定量测定，且与凝血酶法〔3〕测定结果进行对照，含量抗凝效果一致。本文
　　方法快速、方便、灵敏度高，能直接进行大剂量检测，且不受纤维蛋白降解产物(FDP)等其它因素的影响。与高效液相色谱法相比具有操作简便、自动进样等优点。

　　1 研究对象

　　正常人5名，体外循环10例(肝素钠，按360～500U/kg给药)，血液透析23
　　例(10例肝素钠、5例小剂量肝素钠、3例大剂量肝素钠分别按65、10.5、120U/kg
　　给药；5例肝素钙按50U/kg给药)以上均为一次性给药，给药后30min采血。

　　2 仪器与试剂

　　Bio-Focus 3000 Capillary Electrophoresis System(美国Bio—RAD公司)；未涂渍
　　毛细管(30cm×50μm，河北永年光导纤维厂)；肝素钠水溶液(250000U/L，上海
　　生物制药厂产品)，肝素钙水溶液(500000U/L，云南生化制药有限公司产品)。
　　以上2种肝素抗凝活性用美国药典(USP)的标准肝素钠(350000U/L)校正。与厂家
　　标示量相符。SDS(Bio—RAD，USA)电泳纯级，乙腈为色谱纯级，硼砂、氢氧化
　　钠均为国产分析纯级。

　　3 实验方法

　　3.1 血样处理 研究对象静脉采血2mL(109m mol/L的枸橼酸钠1∶9抗凝)，离心，
　　分离出血浆约1.0mL(3000g×15min)，加入乙腈(血浆与乙腈比例为2∶3)混匀，
　　充分混合后放置1min，待蛋白沉淀后再次离心(3000g×15min)，取上清液，仪器
　　自动进样。未经乙腈处理的血浆可保存，但不超过一周，不允许反复冻融。

　　3.2 对照品溶液的配制 精确取250000U/L的肝素钠、500000U/L的肝素钙各
　　10μL混合作为对照液，用双蒸水稀释成500μL。

　　3.3 电泳条件 25m mol/L SDS、pH8.5、25m mol/L硼砂电泳缓冲液，配制方
　　法及毛细管的处理方法按文献〔5〕。毛细管温度20℃，电压20kV，检测波长270nm，
　　自动压力进样55.16kPa。计算采用外标法，用样本与标准的峰面积比求得肝素含量。

　　4 结果

　　4.1 电泳图 肝素钠与肝素钙相对迁移时间均为2.58min，峰型对称，分离良好，
　　达到基线分离。正常人未检出肝素，见图1。含肝素钙血浆标本色谱图与肝素钠类似。

　　a.肝素钠 b.血浆中杂峰

　　4.2 线性范围与最低检测限 用双蒸水将250000U/L的肝素钠、500000U/L的
　　肝素钙水溶液分别稀释成0.1、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0(×103)U/L。
　　以所使用的肝素作相对标准，测得肝素量与峰扫描积分面积之间呈线性关系，回
　　归方程为：
　　Y＝131253.1X-13895.6 r＝0.9988

　　本实验条件下最低检测限为25U/L，S/N为2，肝素含量在80～7000U/L之间线
　　性关系良好。

　　4.3 回收率测定 取正常人血浆1mL 3份，分别加入250、1000、5000U/L肝素钠，
　　按上述方法测出峰面积与双蒸水稀释的标准积分面积对应，计算绝对回收率，每
　　份检测3次，得平均回收率分别为95.6％、97.5％、98.7％，RSD分别为6.2％、5.4％、
　　3.5％。

　　4.4 重复性测定 用2份浓度为500、2500U/L肝素钠测定20次，并作连续监测，
　　其批内RSD分别为3.24％、1.48％；批间RSD分别为4.48％、2.74％。

　　4.5 对研究对象含肝素血样用凝血酶法〔3〕和HPCE法分别进行测定，结果见表1。
　　两法结果近似，P＞0.05

　　两种方法测定血浆肝素含量比较(U/L，X±S)

　　组别 例数(n) 凝血酶法 HPCE
　　体外循环 10 5100±510 5230±490
　　血液透析
　　肝素钠 10 290±100 300±120
　　肝素钙 5 200±100 215±110
　　小剂量抗凝 5 100±20 110±30
　　大剂量抗凝 3 5345±1023 6043±60

正常人血浆中肝素及低分子肝素的含量检测为0(凝固法)