一呼百诺贬义词:花药离体培养中花药应该怎样消毒？

指植物的离体部分（包括任何器官、组织、细胞或原生质体），在人工控制的培养基及环境条件（温度及光照）下，得以生长和分化的一种无菌培养技术。该词最早仅局限用于离体部分增殖形成愈伤组织，现在一般通用于所有类型的植物无菌培养技术。包括：幼苗及较大的植株的培养（植物培养）；离体器官的培养（器官培养）；成熟或未成熟的胚胎的离体培养（胚胎培养）；离体部分增殖形成愈伤组织的培养（愈伤组织培养，即狭义的组织培养）；离体花药的培养（花药培养）；能保持较好分散性的离体细胞或很小的细胞团的液体培养（悬浮培养）；对脱壁的裸露细胞即原生质体的培养（原生质体培养）等。由于培养的部分是离体的，不受体内其它部分干扰，并给以特定的条件，因此，该技术可作为一种手段，研究生长发育和分化的规律。在生产实践中，已用于有经济价值的植物的快速繁殖、培养无病毒植株（分生组织一般不受病毒侵染，故可用茎尖培养产生无病毒植株，如马铃薯）、药用植物和其它有价值的天然产物的工厂化生产以及育种工作等方面。植物组织培养即植物无菌培养技术，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官、组织或细胞，如根、茎、叶、花、果实、种子、胚、胚珠、子房、花药、花粉以及贮藏器官的薄壁组织、维管束组织等，在无菌和适宜的人工培养基及光照、温度等条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株。至今，世界各国在无性系繁殖、花卉育种、植株脱病毒和种质保存等方面，广泛应用组织培养技术。

（一）组织培养技求的应用
用于花药或花粉培养的供体植株，在生长条件下，从幼年的植株取出花药。由于花粉发育时期和花蕾的某些外部形态特征（如花冠筒长度和花冠露出花萼的时间等）之间的大致的相关性，因此可以利用这些外部标志，去选择大致处于所需要时期的花蕾。但在实验中必须由每个花蕾取出一个花药，通过镜检确定花粉发育的准确时期。

在水稻中，以单核靠边期的花粉对诱导单倍体植株较为适宜，在外部形态上可根据叶枕距为5~15cm，颖片淡黄绿色、雄蕊长度接近颖片长度的1/2这些条件鉴定。在取穗前先将旗叶鞘用70%酒精擦洗一遍。在超净工作台内剥去旗内鞘，取出稻穗，放入10%漂白粉溶液中消毒10min，换无菌水洗一次。在取花药之前用70%酒精将手擦洗两遍。取花药时左手持穗，右手用镊子从颖壳中取出花药，放在无菌培养皿中，待花药有一定数目时，用接种环将他们接种到培养基上。培养5天后，花药逐渐变为黑褐色，20天左右花药裂开，从中长出淡黄色的花粉愈伤组织，以后先形成芽，后长出根，形成幼苗。

烟草花药培养的最适取样期是花粉为单核期的花蕾，此时花蕾的花冠大约与萼片等长。芦笋花药培养的最适取样期也是单核期的花粉，花蕾长2~2.5mm，选取一级侧枝的花蕾较为合适，因为在一级侧枝的花蕾发育良好，数量大，发育同步。烟草花药消毒方法基本与水稻花药培养相同。

必须注意整个操作过程中不应使花药受到损伤，若受到损伤，则应淘汰，因为损伤常常会刺激花粉壁形成二倍体的愈伤组织。

花药培养的条件，一般是光照（12~18 h，5000~10000lx,28°C）和黑暗（12~16 h,22°C）周期交替进行。（P106 L.2~P107 L.4）

花药离体培养好像不用消毒吧。
在组织培养里面，我只知道要对“培养基质和培养液要严格消毒”。没听说过要对培养的细胞或组织进行消毒的，因为这样很容易使其失去活性！
因此，组织培养选择培养组织时都会选用活体的新生组织部分，因为这些新生组织活性高，而且没有病毒感染。举个例子：即使一株感染了某种病毒的植物，它的茎尖和根尖刚刚分裂出的细胞也不会马上就感染病毒。
植物的花也是一样。况且生物的生殖系统一般都会有比其他系统更为完善的免疫功能，相对来说更不容易感染病毒。
因此我觉得你这个试验，只要对培养液进行严格消毒，方法很多，我就不说了。然后取新生的花药组织就可以了。没有必要对花药进行消毒。

极度鄙视抄袭别人答案的↑。（X .X）。↑

要的话就联系我（点我可见，我一般三小时内必定回复，如果过了一天还是没有回音的话请使用其他邮箱联系我），我看过了，其实关键的步骤也就几点，不过既然有整个流程的话我想你总归多多益善的。

提高寒地水稻花药培养效率的几个关键技术 CAJ下载 PDF下载

【英文篇名】 Critical Technique Problems on Improving Anther Culture Efficiency of Cold Region Rice
【作者】 关世武;
【英文作者】 Guan Shiwu（Rice Research Institute; Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences; Jiamusi 154026）;
【机构】 黑龙江省农业科学院水稻研究所;
【刊名】 中国农学通报 , 编辑部邮箱 2005年 07期 ASPT来源刊 CJFD收录刊
【英文刊名】 Chinese Agricultural Science Bulletin
【中文关键词】 花药培养; 水稻; 寒地;
【英文关键词】 Anther culture; Rice; Cold region;
【中文摘要】 论述了寒地水稻花药培养操作规程中应注意的几个关键环节,以便使该项技术更好地应用于水稻育种,提高工作效率。①根据器官形态指标外推法选择花粉发育处于单核靠边期的幼穗,进行6￣8℃低温预处理12d左右,可提高愈伤组织诱导率;②愈伤组织转移大小以直径1￣2mm为宜,当绿苗长至4cm左右时及时进行壮苗培养;③做好接种材料、室内、人员的消毒和卫生工作,降低污染率,加强温室等的管理。
【英文摘要】 Some critical technique problems are discussed in this paper, which deserve specially attention in our specific practice so as to enable this technique to better applied to breeding purpose, and to improve efficiency. ① Based on extrapolated organ shape criteria, we select ears that are in uninucleate period, carry out pretreatment in a 6~8℃ low-temperature condition for about 12 days, and callus induction rate can be enhanced in this way. ② 1~2mm diameter should be the appropriate size for translocated cal...
【DOI】 CNKI:ISSN:1000-6850.0.2005-07-012

【篇名】 羽衣甘蓝花药离体培养研究 CAJ原文下载 PDF原文下载
【作者】 黄普乐. 吴伟锋. 孙崇波. 蒋桂华. 张慧琴. 谢鸣.
【刊名】 浙江农业科学 2005年02期 编辑部Email
《中文核心期刊要目总览》来源期刊 “中国期刊方阵”入选期刊 ASPT来源刊 CJFD收录期刊
【机构】 浙江大学农业与生物技术学院. 广西岑溪市园林管理处. 浙江省农业科学院园艺研究所. 浙江省农业科学院园艺研究所 浙江杭州310029浙江省农业科学院园艺研究所. 浙江杭州310021 . 广西岑溪543200 .
【关键词】 羽衣甘蓝. 花药. 离体培养.
【聚类检索】 同类文献 引用文献 被引用文献
【摘要】 以羽衣甘蓝的花药为外植体,通过不同消毒处理时间,采用不同分化阶段的花药、不同激素浓度配比对羽衣甘蓝花药进行离体培养,筛选出最佳消毒处理时间、最佳分化阶段的花药、最佳诱导分化培养基。结果表明,用羽衣甘蓝花蕾大小为4～5mm时期的花药,经01%HgCl2消毒处理8min,在MS+BA3mgL+NAA03mgL诱导分化培养基中诱导愈伤组织及不定芽的总体效果最好
【光盘号】 AGRI0504S1

一、玻片标本的制作技术

制作玻片标本对认识生物体的形态结构具有重要意义。玻片标本有临时玻片标本（如涂片、压片、临时装片）和永久玻片标本（如永久装片、切片）。

1．涂片法

涂片法是将材料均匀地涂布在载玻片上的一种制片方法。

涂片材料有单细胞生物、小型藻类、血液、细菌培养液、动植物的疏松组织、精巢、花药等。

涂片时应注意：（1）载玻片必须清洁。（2）载玻片要持平。（3）涂层须均匀。涂抹液滴在载玻片中间偏右，用解剖刀刃或牙签等涂匀。（4）涂层要薄。用另一载玻片作推片，沿滴有涂抹液的载玻片面（二载玻片夹角应为30°～45°）由右向左轻轻推动，涂成均匀一薄层。（5）固定。如需固定可用化学固定剂或干燥法（细菌）固定。（6）染色。细菌用亚甲基蓝，血液用瑞氏染液。染色液要盖住全部涂面。（7）冲洗。用吸水纸吸干或烤干。（8）封片。长期保存用加拿大的树胶片片。

2．压片法

压片法是将生物材料置于载玻片和盖片之间，施加一定压力，将组织细胞压散的一种制片方法。

压片法的一般过程：（1）取材。观察细胞分裂，应选取细胞分裂旺盛、新鲜的组织细胞为材料。如根尖、茎尖分生组织、骨髓细胞、花药（花粉母细胞）。精巢（精母细胞）等。（2）固定。材料固定可根据需要而定，取材后立即压片观察，可不作单独固定处理（与染色同步进行）；取材后不立即视察，可将材料用固定液（一般用醋酸酒精固定液）固定。固定2～24小时（因材料而异）后用95％乙醇清洗，保存于70％乙醇中，备用。（3）离析。对细胞不易散开材料用水解分离液（如1N HCl或盐酸一酒精液）处理，一般处理6～20min，解离后经水漂洗后方能染色。（4）染色。染色剂种类很多。观察染色体常用醋酸洋红染色液染色。（5）压片。将材料放在载玻片上，加一滴清水或染液，盖上盖玻片用拇指轻轻压片。（6）观察。压片后，即可在显微镜下观察。

3．装片法

装片法是将生物材料采取整体封固制成玻片标本的方法，用此法可制成临时或永久装片。

装片材料有：微小生物如衣藻、水绵、变形虫、水螅，植物的叶表皮；昆虫的翅、足、口器，人的口腔上皮细胞等。

装片法制作时应注意：（1）手持载玻片时，应注意持平，或放在平台上。滴水时水量要适当，以恰好被盖玻片盖满为度。（2）应将材料用解剖针或镊子展开不使重叠，展平在同一平面上。（3）放盖玻片时，从一侧慢慢盖在水滴上，防止出现气泡。（4）染色时，将一滴染色液滴在盖玻片的一侧，用吸水纸从另一侧吸引，使盖玻片下的标本均匀着色。着色后，用同样的方法，滴一滴清水，把染色液吸出后，在显微镜下观察。

二、显微镜基本实验技术

1．低倍镜（4X、10X）的使用方法

显微镜操作主要包括两个方面：（1）光度调节。正确对光是能否成功地观察到物象的首要条件。对光时，先把聚光器上提，打开可变阑，转动反光镜，这时一边看镜内视野，一边调节聚光器螺旋，直至视野内得到均匀而明亮的光线。（2）焦距的调节。调焦时，先把观察的切片，用推进器对正通光孔中央。然后分两步调焦。先用粗调器定焦，用左眼看目镜，使粗调器慢慢上升，直到能清楚地看到标本为止。随后调节细调器，使镜筒微微升降，至物象更清晰为止。

2．高倍镜（40X）的使用方法

（1）将在低倍镜中找到的物象欲放大部分移到视野中央。（2）转动物镜转换器，使40X物镜对准通光孔，转动时从侧面注视物镜，以防镜头紧压玻片。（3）调节细调螺旋，使物象清晰。

3．油镜（100X）的使用方法

（l）先用低倍镜找到欲观察细微结构，将其结构移至视野中央换高倍镜。（2）下降镜台，在玻片标本上滴一滴香柏油，转换油镜。从侧面注视油镜，把镜台上升，使油镜头浸在香柏油滴中。（3）转动细调螺旋，使物象清晰，进行观察。（4）观察完毕，用镜头纸擦去油镜头和玻片上的香柏油，再用少许二甲苯或乙醚 / 无水乙醇把镜头擦干净。

4．安装指针的简易方法

将目镜的上盖（一片透镜）旋下，剪取一小段头发（其长度约等于目镜的半径），用镊子夹住一端，将另一端蘸少许中性胶，将其粘在目镜内壁的金属光栏（一铁圈）上。稍干后，旋紧上盖，即可使用。

三、单细胞的计数方法

在细菌培养和体外细胞培养，以及环境监测血液检查中常常需要统计细菌、细胞、单细胞藻类、原生动物、血细胞、花粉等数量。细胞计数方法的原理是把一定体积的细胞液体，在显微镜下直接计算其个数，利用所得结果推算出每毫升水体中的单细胞数。具体方法如下：

1．水滴计数法

用管口圆而平滑、大小适宜的吸管，吸取1mL水，然后测定这一吸管1rnL水可滴出多少滴水（反复测定，直到准确为止）。这样可以计算出该吸管滴出的每一滴水的体积。用吸管取样时，如果单细胞是活动的要用碘杀死后，再计数；如果样品浓度太大，计数困难，按倍数稀释到适宜的浓度；另外，取样前必须搅拌，搅拌后，立即取样。取样后，在显微镜下计数，得到一滴水中细胞数的平均值后，可依下列公式求出1mL水体中所含细胞的数目。

1mL水体中含细胞数＝计数平均值×定量吸管每毫升的滴数×稀释倍数

2．血球计数板计数法

血球计数板是由一块厚玻片特制而成，其中央有两个计数室。每个计数室划分出9个大方格（见下图），每格面积1mm2，加盖玻片后的深度为0.1mm。因此，每大方格容积为0.1mm。另外，中央大方格以双线等分为25个中方格。每个中方格又分16个小方格，供细胞计数用。

MPEG-2的图象质量非常不错，但动辄上G的体积并不容易在网络上传播。MPEG-4制定于1998年，主要是达到质量和体积的平衡，通过帧重建等技术，MPEG-4标准可以保存接近于DVD画质的小体积视频文件。MPEG-4格式还包含了以前MPEG标准不具备的比特率的可伸缩性、交互性甚至版权保护等特殊功能，正因为这些特性，MPEG-4格式被誉为“DVD杀手”。采用这种视频格式的文件扩展名包括.asf、.mov等等。

消毒的原则：消毒剂与外植体应接触足够长的时间以除去外植体表面的微生物，但应尽量减少对外植体细胞的破坏。
消毒方法：冲洗植物材料除去泥土等大的颗粒→浸入70-75％乙醇，有利于植物表面的浸湿→用5-20％NaClO溶液（加1滴表面活性剂）表面消毒5-10min→用无菌水冲洗至少3遍→与消毒剂接触过的切面在转移到无菌培养基前应切去，因为消毒剂会杀死外露的细胞从而影响营养吸收→切取外植体，通常为10mm的茎段和直径10mm的叶片部分（太大激素作用减弱，太小则不易成活）。
消毒注意事项：1、表面消毒剂对植物组织是有害的，应正确选择消毒剂的浓度和处理时间，以减少组织的死亡。2、在表面消毒后，必须用无菌水漂洗材料3次以上以除去残留杀菌剂，但若用酒精消毒，则不必漂洗。3、与消毒剂接触过的切面在转移到无菌基质前需将其切除，因为消毒剂会阻碍植物细胞对基质中营养物质的吸收。4、若外植体污染严重则应先用流水漂洗1小时以上或先种子培养得到无菌种苗，然后用其各个部分建立组织培养。5、HgCl2效果最好，但对人的危害最大，用后要用水冲洗至少5次